德泰生物新年大促,蛋白表達限時9折優惠

发2元彩票当年终奖:原核蛋白表達服務

2元彩票券 www.hzgenk.com.cn 德泰生物擁有超十年的蛋白表達經驗,已成功交付2000+組蛋白,包括毒性蛋白、生長因子、酶等。主要應用于:作為抗原制備抗體;參與細胞實驗與動物實驗;測定蛋白酶活;研究蛋白相互作用(免疫共沉淀,GST pull down);蛋白結晶結構研究,免疫組化實驗等,不同的應用對于蛋白的要求也互不相同。在進行蛋白表達時,通常要考慮以下幾點:

  • 蛋白本身特性:蛋白的分子量大小,蛋白來源/物種,是否為毒性蛋白,蛋白翻譯后修飾程度,蛋白結構復雜程度,在細胞內外的定位等;
  • 蛋白表達系統選擇:不同蛋白表達系統有不同的優勢,如表達量高低,能否糖基化修飾等,結合蛋白應用并全面考慮,選擇最合適的蛋白表達系統;
  • 蛋白需求量:不同下游應用需求量有所區別,制備抗體需2~8mg,常規功能學研究10~200ug,細胞實驗或藥物研究則需更多;
  • 蛋白純化標簽去留:蛋白純化標簽主要有His,GST,SUMO,MBP等。His標簽只有0.84kd,利于純化且對蛋白無影響,可以保留;其他屬于大標簽,可以提高蛋白可溶性,但需要切除,否則會影響蛋白結構功能。
服務內容 服務內容 德泰交付 周期 價格
原核蛋白表達 蛋白表達
不成功,不收費!
  • 表達載體/表達菌株;
  • 3-5mg,>90%純度蛋白
  • 質檢報告
  • 項目流程報告
4~6周 詢價
內毒素去除服務
(可?。?/td>
包括制備過程中內毒素控制及純化過程中內毒素去除兩部分,內毒素水平控制在0.01~1.0 EU/ug
  • 內毒素質檢報告
大規模發酵服務
(可?。?/td>
利用發酵工藝,提供毫克至克級重組蛋白制備,滿足大量制備的需求
  • 最終交付客戶需求的蛋白量(或菌泥)
  • 詢問

    實驗流程

    實驗流程 服務特色 周期
    密碼子優化 自主研發MaxCodonTM生物信息學軟件,對稀有密碼子、密碼子偏好性等因素進行分析優化(什么是密碼子優化? ~2周
    基因合成&載體構建 德泰擁有幾十種表達載體:pET系列(pET28a、pET30a、pET43.1 a等),pGEX4T-1、pBAD24、pGADT7、pQE-30等
    表達小試 根據蛋白的性質選擇合適的菌株:BL21 (DE3) 、OrigamiB(DE3)、Rosetta(DE3)、BL21 CodonPlus(DE3)、codon Plus(DE3)、ESL等
    多種表達條件優化,增加可溶性蛋白表達量
    1周
    放大表達&蛋白純化 放大表達&純化,交付您需要的蛋白量
    四大蛋白純化方法,先進的AKTA純化設備,可純化標簽/無標簽蛋白
    2~3周
    蛋白質檢 SDS-PAGE、WB檢測、質譜檢測(可?。?/td>

    原核表達案例

    案例為蛋白酶A的制備,該蛋白的制備難點在于:
    a. 該蛋白酶自身含有酶切位點,表達很難獲得目的蛋白,在前段加入一段非信號肽的前肽,可以抑制蛋白酶A的活性,再通過快速純化獲得;
    b. 在純化過程中需要對該段前肽進行切除,需要低溫快速純化,難度較大;
    c. 切除后的蛋白不含有標簽,不能用標簽親和純化,需要利用磁珠對目的蛋白進行純化。

    制備流程

    蛋白表達:目的蛋白很難直接表達出來,通過在蛋白序列前段加入一段非信號肽的前肽,使目的蛋白成功表達;
    蛋白純化:采用胰凝乳蛋白酶對加入的前肽進行切除。實驗人員對酶切條件進行了多次摸索,包括酶切的時間、胰凝乳蛋白酶濃度、是否需要加抑制劑、抑制劑濃度及抑制時間等(全程共用凝膠34塊)。最終找到了合適的酶切條件成功將前肽切除掉。自制磁珠親和純化柱,驗證可用后利用磁珠親和純化柱純化得到目的蛋白。

    蛋白酶A純化電泳圖

    Lane M:SDS-PAGE Protein marker
    Lane 1:酶切前
    Lane 2:酶切后不加抑制劑
    Lane 3:酶切后+抑制劑(TPCK)
    Lane 4:與NHS磁珠孵育后FT
    Lane 5-6:洗雜
    Lane 7-10:洗脫目標蛋白

    圖1:純化得到目的蛋白

    原核表達系統

    原核表達系統是通過原核生物來獲得外源蛋白的體系。原核表達是目前常用的重組蛋白表達方式之一,操作相對簡便,要求較低。相對哺乳動物表達系統更加經濟節約。但是也常常遇到一些問題,比如原核表達蛋白表達量低?蛋白不表達?蛋白表達不在上清易形成包涵體等情況,本文主要根據實驗經驗總結原核蛋白表達的兩個問題蛋白為什么不表達和蛋白表達為什么不在上清,并提出針對性的解決方案,幫助我們提高實驗的成功率。

    蛋白表達為什么不在上清?

    大腸桿菌的表達部位通常在細胞質中,細胞周質中,細胞外。
    周質中表達的蛋白質,分離純化簡單,而且周質中的氧化環境有利于蛋白質的正確折疊,但是蛋白產量很低
    胞內表達是外源蛋白在大腸桿菌中主要的表達形式,但是由于大腸桿菌的細胞質環境呈現還原性,不利于蛋白二硫鍵的形成和穩定,從而導致蛋白的不準確折疊,形成不溶性的包涵體… 更多

    如何提高蛋白可溶性?

    可溶性策略
    • 選擇合適的宿主細胞
    • 采用融合標簽表達
    • 選擇合適的質粒載體
    • 分泌型表達
    • 優化培養條件

    更多原核表達系統內容

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