2元彩票优惠券:抗體親和力測定

2元彩票券 www.hzgenk.com.cn 抗體與抗原表位或抗原決定簇之間的結合力稱為抗體親和力,下載其本質是一種非共價作用力,包括對氨基酸之間的吸引力,氫鍵,疏水性作用力等??固邇綴土μ逑至艘桓隹固宸腫雍鴕桓靄肟乖腫踴蚩乖腫擁囊桓鼉齠ù仄鴟從Φ哪芰?。
抗體親和力的大小可以用親和力常數KD(單位為升/質量摩爾濃度)表示,其計算公式為

KD=[Ab?H]/([Ab][H])

其中[ ]表示摩爾濃度,Ab表示抗體,H表示半抗原,Ab—H表示抗體與半抗原的結合物
親和力常數KD越高,則抗體結合半抗原的能力越強??固邇綴土Φ那咳躒【鲇誑固宥暈唬≒aratope)與所用抗原表位(epitope)之間的配合程度,包括接觸面積的大小、吻合的密切程度、以及帶點基團與疏水基團的分布等。
親和力高低影響因素圖解

圖1:親和力高低影響因素圖解

抗體親和力測定方法

生物膜干涉技術(BLI)

根據生物膜干涉技術(BLI),可利用Fortebio Octet?檢測儀器對抗體親和力進行測定的原理為:生物傳感器底端由固定的相互作用分子組成的生物膜層覆蓋,當具有一定帶寬的可見光垂直入射生物膜層時,光在生物膜層的兩個界面反射后形成被光譜儀檢測到的一定波長的干涉波。固定分子與溶液中分子發生相互作用時,生物層厚度增加,干涉光譜曲線向波長增加的方向移動,相位移動由工作站探測并分析,可定量得出傳感器表面分子數量變化及相關濃度與動力學數據。
Fortebio Octet?實驗原理

圖2:Fortebio Octet?實驗原理

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固相放射免疫法(SP-RIA)

固相放射免疫法可以比較準確的測出抗體親和力常數,其操作步驟為:用抗原(如病毒顆?;虻鞍字剩┌晃?,加入系列稀釋的定量單克隆抗體。溫育至反應平衡后,洗去未結合的單克隆抗體加放射性同位素標記的抗小鼠lg第二抗體,溫育后洗滌,將小孔割下計數結合的放射性強度。只要保持包被抗原量恒定,即可按公式([Ab]a/[Ab]r-[Ab]B)/(Ab)a=-nK。其中[Ab]a為結合抗體濃度,[Ab]r為總抗體濃度,n為抗體結合價,K為親和力常數。

平衡透析法

利用平衡透析法進行抗體親和力的測定需要兩個前提:配體(半抗原分子)要為小分子且可以穿過半透膜;配體分子可以以某種方式標記(例如同位素3H)

平衡透析法測抗體親和力圖解

圖3:平衡透析法測抗體親和力圖解

將放射性標記的配體溶于緩沖液置于中間由半透膜隔開的透析室的一側(F室),將非特異性抗體置于透析室的另外一側(B室)。隨著時間的推移,配體會透過半透膜從F室到達B室,配體與非特異性抗體不發生結合,則各室的配體濃度隨時間變化如右圖所示。

平衡透析法測抗體親和力圖解

圖4:平衡透析法測抗體親和力圖解

將放射性標記的配體溶于緩沖液置于中間由半透膜隔開的透析室的一側(F室),將非特異性抗體置于透析室的另外一側(B室)。隨著時間的推移,配體會透過半透膜從F室到達B室,在B室中配體與特異性抗體結合,各室的配體濃度隨時間變化如右圖所示。

當抗原-抗體結合反應Ab+H?Ab?H達到平衡時,利用方程式1/[b]=1/k×1/[Ab]×1/[H]+1/[Ab]即可計算得到親和力常數K(其中[b]為結合配體的質量摩爾濃度,[H]為游離配體的質量摩爾濃度,[Ab]為抗體結合位點濃度,由抗體質量摩爾濃度×抗體結合價得到)。

對于無法穿過半透膜的大分子抗原,可以利用能穿過半透膜的Fab抗體片段來進行抗體親和力的測定實驗。

結合抗原沉淀法

將單價抗原與相應抗體同在溶液中溫育進行抗原-抗體反應。在反應達到平衡后,用50%飽和硫氨酸或15%聚乙二醇進行沉淀,將結合與游離抗原分離,分別測定濃度,繼而按照上述公式計算出親和力常數K。

放射免疫法(RIA)

將系列稀釋的定量單克隆抗體與痕量的放射標記抗原分子在溶液中一同溫育(單克隆抗體必須大大過量),平衡后測定結合曲線。根據米-曼氏動力學原理,50%最大結合處單克隆抗體結合價濃度的倒數即為親和常數K。

酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)

ELISA的靈敏度很高,利用ELISA可以測出10-8M數量級的親和力常數,可以滿足一般抗體親和力的測定需要。且ELISA無需對抗原或抗體進行標記,操作簡便易行,是目前常用的親和力測定方法。其操作方法為:將抗體與定量的抗原一同在溶液中溫育,進行抗原-抗體反應。當反應達到平衡后,將溶液移至包被有相同固相抗原的聚苯乙烯微板中,用常規間接法ELISA測定溶液中剩余的游離抗體量。利用測出的OD值直接計算出親和常數。當所用抗原≥所用抗體量10倍時,計算中可對抗體量忽略不計,這時可以用公式A0/(A0-A)=1+Kd/a計算出親和力。其中A0為無抗原存在時抗體的OD值,A為加入了質量摩爾濃度為a的抗原后的OD值,Kd為抗體親和力常數的倒數。競爭ELISA法測定抗體親和力

表面等離子共振法(SPR)

SPR測定抗體親和力是基于表面等離子共振技術建立的一種親和力測定技術。只需按照儀器說明對進行操作,在加好樣品后,便可以得到親和力常數。相較于競爭ELISA法,SPR法測定抗體親和力有諸多優勢,如可以實時監測反應的動態過程,實驗結果重現性好、儀器記錄的數據不能隨意更改,減少了主觀因素的影響、實驗的重復性更好等。表面等離子共振法測定抗體親和力

抗體親和力測定的意義

在重組抗體被生產出來之后,必須對其進行親和力測定以保證可以順利的應用于下游應用。在RIA、ELISA、免疫熒光檢測(IFA)等免疫學實驗中,抗體對特異性待測抗原的親和力必須高于一定的閾值,才能保證測定的靈敏度和可靠性。用抗體偶聯于固相進行親和純化抗原時,為避免強烈的洗脫條件造成抗原變性,需中等親和力的抗體,以便能用較溫和的條件進行洗脫。由于一般抗血清抗體是親和力相差很大的多克隆抗體混合物,用于上述不同目的時,其中相應親和力的組分將能發揮預期的作用。而用單克隆抗體取代多克隆抗體血清時,就必須對其親和力進行測定,才能選出合適的備用者。另外,由于某些單克隆抗體對某一抗原的特異性親和力隨環境條件(如溫度、PH、離子成分與強度等)的改變(甚至很微小的變化),會有很大的差別,故為某一目的而選擇單克隆抗體時,應采取與實際應用時條件相仿的方法測定其親和力。

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金建平,《生物工程學報》,1987,3 (3):110-113

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