2元彩票最高中多少:雙向凝膠電泳原理/實驗步驟

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雙向凝膠電泳,廣義上理解就是將某一樣品進行電泳后,為了達到不同的分離目的在它的直角方向在進行一次電泳。常用的就是等電聚焦電泳(載體兩性電解質pH梯度或固相載體pH電泳)之后在進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳。樣品經過電荷和質量兩次分離之后,可以知道樣品的分子量等電點等信息,分離的結果不是帶而是點。

以等電聚焦–聚丙烯酰胺凝膠電泳為例的實驗操作
雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳實驗步驟

(一)水化上樣

  1. 從冰箱中取出IPG膠條,室溫下下放置10min;
  2. 沿著水化槽的邊緣從左向又加入樣品(槽兩端各1cm不加樣品),中間樣品液一定要連貫,不要產生水泡,不然會影響膠條中蛋白質的分布;
  3. 用鑷子輕輕撕去IPG膠條的?;げ悖钚遠私洗噯?,應該小心操作);
  4. 將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品液上(不要將樣品液弄到膠條背面,因為這些溶液不會被膠條吸收,還會使膠條下面產生氣泡,如果有氣泡,來回移動膠條,直到趕走氣泡)
  5. 放置40min,直到大部分的樣品被膠條吸收,慢慢加入礦物油,防止膠條水化過程中液體蒸發
  6. 將等電聚焦儀放于-20℃,水化11-15小時。

(二)等電聚焦

  1. 將紙電極置于聚焦盤的正負極上,加去離子水5-8ul;
  2. 取出水化好的膠條,將礦物油瀝干,膠面朝下,將其置于潤濕好的濾紙片上去除表面的不容物;
  3. 將IPG膠條面朝下置于聚焦盤中,膠條的正極對應于聚焦盤的正極,確保膠條與電極精密接觸;
  4. 在每根膠條上滴2-3ml的礦物油;
  5. 對好正負極,蓋好蓋子。設置等電聚焦程序;
  6. 聚焦結束的膠條,立即進行平衡,第二向SDS-PAGE電泳或者是保存于-20℃,電泳前10min時取出。

(三)SDS-PAGE電泳

  1. 配制12%的丙烯酰胺凝膠;
  2. 配制膠條平衡緩沖液;
  3. 準備厚的濾紙,聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上,將另一份厚濾紙用Millio水浸濕,汲取多余水分,然后直接置于膠條上,輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品,這樣可以減少凝膠染色時出現的縱條紋;
  4. 將膠條轉移至樣品水化盤中,加入6ml(17cm IPG)平衡緩沖液I,在水平搖床上搖晃15min;
  5. 配制膠條平衡緩沖液Ⅱ,第一次平衡技術后,濾紙上離去多余的液體,放在平衡緩沖液Ⅱ中,繼續在水平搖床上緩慢搖晃15min;
  6. 用濾紙吸去SDS-PAGE膠上方玻璃板間多余的液體,將第二向凝膠放在桌面上,凝膠的頂部面對自己;
  7. 瓊脂糖液體加熱溶解,在100ml量筒中加入TGS電泳緩沖液;
  8. 第二次平衡結束,取出膠條,用濾紙吸去多余的平衡液,用鑷子夾住膠條一端,使膠面完全浸入在電泳緩沖液中漂洗幾次;
  9. 將膠條背面朝向玻璃板,輕輕放在長玻板上,加入瓊脂糖封膠液;
  10. 注意不要在膠條下產生氣泡,將膠條和聚丙烯酰胺凝膠面完全接觸;放置幾分鐘,待瓊脂糖凝固;
  11. 打開二向電泳制冷儀,調溫度至15℃;
  12. 將凝膠電泳轉移至電泳槽中,加入電泳緩沖液,接通電源,一開始低電流,待樣品完全走出IPG膠條,濃縮成一條線后,加大電流,溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳;進行染色觀察。
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